| | | AT2受体对成年大鼠心肌成纤维细胞ET1蛋白及其mRNA水平的影响
| | 西医学 免费论文【关键词】 心肌成纤维细胞； AT2受体； AT1受体； ET1
1材料和方法
1.1材料
雄性SD大鼠，体质量230~250 g（西安交通大学医学院实验动物中心提供）；血管紧张素Ⅱ（angiotensin II，AngⅡ），受体特异性阻断剂（PD123319）（美国Sigma公司）；氯沙坦（losartan，Los）（美国Du Pont &Merk Pharmaceuticals公司）；RTPCR试剂（美国Promega公司）；内皮素1(endothelin1, ET1)放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所)；兔抗大鼠AT2 多抗(武汉博士德公司).
1. 2方法
1.2.1大鼠心肌成纤维细胞的西医学 免费论文分离培养
采用西安交通大学医学院生理学与病理生理学教研室已建立的西医学 免费论文胶原酶Ⅰ，胰蛋白酶消化及差速贴壁的方法分离培养原代心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs). 细胞培养至亚融合状态经12 h无血清预适应后, 进行药物干预.
1.2.2免疫组化测定
AT2表达将细胞分为6组：对照组，1 mol/L AngⅡ组，10 mol/L Los组和0.1, 1, 10 mol/L AngⅡ+10 mol/L Los组. 药物作用48 h后进行常规免疫组化.
1.2.3RTPCR检测
ET1 mRNA水平将细胞分为3组：AngⅡ组，AngⅡ+ Los组，AngⅡ+ PD123319组. 药物浓度均为10 mol/L,作用48 h后抽提细胞总RNA逆转录合成cDNA, 进行30个循环的扩增（94℃变性，1 min; 65℃或57℃退火，1 min; 72℃延伸，1 min）；72℃延伸5 min. ET1引物：sense: 5′CAGGTCCA AGCGTTGCTCCTGCTCCTCC3′; antisense: 5′CACCACGGG GCTCTGTAGTCAATGTGCTCG3′, 产物长度483 bp. βactin: sense: 5′CCTGT ACGCCAACACAGTGC3′; antisense: 5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′, 产物长度211 bp. 琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带灰度，以ET1与βactin的比值作为半定量指标.
1.2.4放免法检测
ET1的分泌将细胞分为4组：对照组，Ang Ⅱ组，Ang Ⅱ+ Los组，Ang Ⅱ+ PD123319组，药物浓度均为10 mol/L,48 h后收集细胞上清液，按ET1放免试剂盒说明书进行测定，检测范围：10~2000 pg/mL.
统计学处理: 数据以x±s表示, 用SPSS 10.0统计软件进行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1AT2 受体的表达
在6组细胞中，仅在10 mol/L AngⅡ+ 10 mol/L Los组观测到AT2受体呈现高表达，其余各组没有表达AT2受体，呈阴性结果. 2.2ET1mRNA的表达
半定量统计分析结果显示：ET1 mRNA水平在AngⅡ组，AngⅡ+ Los组和AngⅡ+ PD123319组分别为0.883±0.031, 0.881±0.023和 0.860±0.040, 与AngⅡ组相比较，Los阻断AT1受体和PD123319阻断AT2受体，对ET1mRNA的表达未见影响（n=6， P>0. 05，图1）.
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