| | | 结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达
| | 药学类毕业论文【摘要】 目的药学类毕业论文：应用分子生物学技术，构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒，并在真核细胞中表达. 方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因，同时从质粒pORFhGMCSF中扩增出基因佐剂hGMCSF，分别克隆到真核表达载体pIRES的药学类毕业论文多克隆位点A（MCSA）和B（MCSB）中，构建pIHsp65GM真核表达质粒，并转染HepG2细胞中表达和检测. 结果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb，测序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列与GenBank上公布序列完全一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGMCSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论：成功构建和表达了pIHsp65GM质粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.
【关键词】 结核分枝杆菌；热休克蛋白65；人粒巨噬细胞集落刺激因子；双顺反子；基因佐剂
0引言
卡介苗（bacille calmetteguerin, BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis, TB）的减毒活疫苗. 由于结核DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一［1］. 结核杆菌热休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD, Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应［2］.粒细胞吞噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, GMCSF)作为良好的基因佐剂,可以利用其上调机体免疫水平的作用增强DNA疫苗的效能［3-4］. 虽然Hsp65抗原和GMCSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GMCSF协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚［5］. 我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和基因佐剂hGMCSF的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核DNA疫苗的免疫效果奠定基础.
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