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GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL12真核双表达质粒的构建及表达
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【免费的医学论文】作者:陶崑,王东,曾建明,黄世峰,陈新敏,曹唯希,黄宗干,冯文莉【摘要】 目的: 构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL12(mIL12)真核双表达质粒,在COS7细胞中检测其基因和膜蛋白表达. 方法 : 以含有慢粒白血病(b3a2型)migP210全长序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,酶切后插入pBudCE4.1空载中,经鉴定获得重组质粒pBB. 同时,RTPCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI锚定序列,酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因片断羧基端相连,获得重组质粒pBBG并鉴定. 然后扩增mIL12基因片段并亚克隆入pBBG另一多克隆位点,构建重组质粒pBBGI. 在多聚阳离子介导下将pBBGI质粒转染COS7细胞,采用RTPCR, Western Blot检测bcr/abl融合基因及其蛋白的表达,ELISA检测mIL12的表达. 结果: 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL12基因插入片段正确;转染细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达,细胞培养上清中也有mIL12的表达. 结论: 成功构建能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL12的重组质粒PBBGI,为进一步 研究 bcr/abl基因疫苗诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础. 【关键词】 bcr/abl融合基因;糖基磷脂酰肌醇类;白细胞介素12;真核双表达 0引言 慢性粒细胞白血病(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体,即t(9;22)(q34.1;q11.2),形成bcr/abl融合基因并表达具有强烈酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白,后者使造血干细胞异常转化而导致CML发生. p210融合蛋白属于肿瘤特异性抗原,其抗原性由bcr/abl基因的融合区域决定. 然而,bcr/abl融合蛋白是CML细胞的胞内蛋白,如何将其有效递呈到CML细胞膜表面从而持续诱导特异性细胞免疫并成为
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