|
RNAi抑制胰腺癌细胞株VEGF表达的实验研究
|
|
【动物西医学毕业论文】作者：赵鑫,李德春,张子祥,赵华,岑建农【关键词】 RNA干扰；Panc1；VEGF；PCR；ELISA0引言血管内皮细胞生长因子(VEGF)是体内一种内皮细胞特有的有丝分裂原，调控血管内皮细胞的增殖、迁移、水解基膜和血管构建，诱发血管期的启动[1，2] 。RNA干扰(RNAi)是一种重要的转录后基因沉默机制[3]。本实验拟构建以VEGF基因为靶向的RNA干扰质粒，沉默胰腺癌Panc1细胞株中VEGF基因的表达，为抑制胰腺癌血管生成提供基础。
1材料与 方法
1.1主要材料siRNA真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP和阴性对照载体购自上海吉凯基因化学公司，abl、VEGF基因PCR引物及探针由上海生工公司合成；人VEGF ELISA试剂盒为美国R&D公司产品。
1.2方法
1.2.1pGCsiVEGF的构建与细胞转染 参考 siRNA的设计策略，从VEGF基因第三外显子上挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列(5'GGAGTACCCTGATGAGATC3′)，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，中间以9个脱氧核苷酸的Loop相连。取合成两条shRNA的模板单链，退火形成siRNA载体插入片断，见图1。取空质粒用BamHI和HindIII行双酶切，电泳，切胶，回收线性质粒，纯化。将上述片断接入线性化质粒，得到重组子命名为pGCsiVEGF。对其进行测序。脂质体法将pGCsiVEGF和阴性对照质粒转染Panc1细胞。转染后的细胞用含G418培养液筛选2周后挑取阳性单克隆继续培养4周，用流式细胞仪检测筛选后的GFP表达率。
1.2.2Real Time PCR和ELISA取转染阳性克隆细胞，提取细胞内总RNA，逆转录合成cDNA链。以看家基因abl的表达作为内参，abl和VEGF的引物及Taqman探针序列如下：Abl 引物：正义5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA 3′；反义5′ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG 3′； ab
|
|
|
广告服务