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“酚氯仿裂解法”提取质粒DNA
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【西医学免费毕业论文下载】作者：张林琳，李翔，张栋，贺大林，李磊，王新阳【关键词】 质粒DNA；酚氯仿；提取；内切酶；聚合酶链反应；电泳【关键词】 质粒DNA；酚氯仿；提取；内切酶；聚合酶链反应；电泳
1材料和 方法
1.1材料含有人柯萨奇腺病毒受体 (human Coxsackie and adenovirus receptor, hCAR）基因的真核表达质粒载体pIRES2EGFPhCAR由本 研究 所构建；转化菌E.coli DH5a由本研究所保存；内切酶PstI购自TaKaRa公司. LB培养基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g）. Tris饱和酚、氯仿按1∶1体积比配制成混合液；无水乙醇；RTE溶液： 10 mmol/L TrisHCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA＋20 mg/mL RNase A（无DNase）. 直径35 mm可反复使用针式小滤器及0.22 μm滤膜购自华美生物生物公司.
1.2方法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）. 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据 参考 文献 ［1］设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况.<
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