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人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定

【西医学评职论文下载】【摘要】 目的 构建人正常胃黏膜细胞的cDNA文库并鉴定文库质量。方法 运用mRNA 5′末端的模板转换方法以powerscript 逆转录酶进行转录,在mRNA的5′末端添加一段5′oligo 做为延伸后的模板,从而富集全长cDNA.扩增后的cDNAs经XhoI酶切、柱层析洗脱,重组于pGADT7载体并包装后,测定滴度、重组率,扩增文库。随机挑取16个克隆行PCR 反应扩增插入片段。结果 构建的cDNA 文库滴度为4.00 ×106 pfu/ml,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109 pfu/ml,16个插入片段长度为0.5~2.0 kb.结论 构建的人正常胃黏膜细胞cDNA文库为高效全长的酵母双杂交cDNA 文库,符合cDNA 文库的要求,可进一步用酵母双杂交的方法探寻与胃疾病相关的基因。
【关键词】 胃黏膜细胞;cDNA文库;全长
【Abstract】 Objective To construct a fulllength cDNA library of human gastric mucosa and identify the quality of the library.Methods The library was constructed by using the templateswitching technique at 5′ end of mRNA.A powerscript reverse transcriptase was used to transcribe,and a 5′ oligo fragment as an extended template was added t o 5′end of mRNA to enrich fulllength cDNAs.After amplification,the cDNAs digested by XhoI and sizefractionated by columns were recombined into pG
 
 
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