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激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件
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【免费医学论文网】作者：季颖 王清清 付洁 高新 宋海峰【摘要】 寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤。本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CELIF)，通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察，研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素，并对其进行优化。结果表明，随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同，其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外，初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同。因此， 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化。本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为：初始模板的量为105个分子，DNA聚合酶浓度0.05 U/μL，退火温度70 ℃，18个循环。本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子，降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据。
【关键词】 毛细管电泳;指数富集系统配基进化技术;聚合酶链式反应;寡核苷酸文库; 适配子
1 引 言
核酸适配子(Aptamers)是从大量的组合化学库中筛选出的短链寡核苷酸，它具有靶分子范围广、稳定性好、亲和力高等特点，从亲和分析到疾病诊断与治疗方面，为自然科学和生命科学领域带来了革命性进展[1,2]。目前用于治疗老年性黄斑退行性病变第一个适配子药物Macugen已于2004年获得了美国FDA批准[3]。
筛选适配子的经典方法是指数富集配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，主要有3个关键步骤：随机寡核苷酸文库的设计合成、结合适配子与未结合适配子的分离和结合适配子的PCR扩增。文库PCR过程中非特异性产物的出现是一个普遍的现象，而聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)扩增条件的特异性决定了SELEX技术筛选与靶蛋白特异性结合的适配子假阳性的高低，因此结合适配子的PCR扩增是
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