|
高效液相色谱荧光紫外法测定动物肌肉组织中多类药物残留
|
|
【制药类毕业论文】作者：李存 江海洋 吴银良 王战辉 赵思俊 【摘要】 建立了同时检测动物肌肉组织中9种喹诺酮类药物、7种磺胺类药物和甲氧苄啶的高效液相色谱检测方法。动物肌肉组织样品用磷酸盐缓冲液提取，HLB固相萃取柱净化，洗脱液用氮气吹至近干，磷酸盐缓冲液复溶，以甲酸水溶液乙腈体系为流动相，梯度洗脱，荧光紫外检测器串联测定。本方法的线性良好，相关系数r>0.9987;平均回收率为70.6%～103.4%，相对标准偏差为1.2%～11.4%; 荧光检测器测定喹诺酮类药物的检出限为0.04～0.4 μg/kg;紫外检测器测定磺胺类药物和甲氧苄啶的检出限为3.5 μg/kg。本方法具有简便、通用性强的特点，适用于动物肌肉组织中上述药物的常规残留检测。
【关键词】 喹诺酮类药物，磺胺类药物，甲氧苄啶，动物肌肉组织，高效液相色谱法，多残留检测
1 引 言
喹诺酮类药物(quinolones，QNs)和磺胺类药物(sulfonamides，SAs)都属于人工合成的抗菌药物，因其抗菌谱广而广泛用于预防和治疗食品动物的多种感染性疾病。甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)作为一种抗菌增效剂，可以增强QNs和SAs的抗菌作用，常与其配合使用[1]。这些药物在兽医临床广泛和大量的使用必然会导致其在动物性食品中的残留，严重危害人类的健康。我国和欧盟都已制定了多种QNs和SAs在动物组织中的最高残留限量[2,3]。QNs或SAs在动物组织中与高效液相色谱(HPLC)串联的检测方法主要有紫外法(UV)[4～7]、荧光法(FLU)[8,9]和质谱法(MS)[10～12]。国家标准中，检测猪和鸡组织中QNs残留的HPLC方法的检出限为20 μg/kg[13]，SAs残留的HPLC方法的检出限为10～20 μg/kg[14]。为提高检测效率，多类(multiclass)残留检测,即一个方法可以同时检测两类以上的药物，已成为发展趋势[15～17]。但有些方法灵敏度较差[17]，或仪器价格昂贵不易推广应用[16]，或检测药物较少[15,17]，而且不能同时测定TMP[15～17]，甚至在提取和净化中使用大量的毒性高的有机溶剂，如使用氯制剂[5,7,9]。本研究建立了同时检测动物肌肉组织中9种QNs、7种SAs和TMP的HPLC检测方法。组织样品用磷酸盐缓冲液提取，固相萃取柱净化，方法简便、通用性强、有机溶剂用量少。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Waters 26952996高效液相色谱仪，配备有2487紫外检测器和2475荧光检测器(美国Waters公司); HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，美国Waters公司)。磷酸盐缓冲液：称取2.0 g K2HPO4·3H2O和8.0 g KH2PO4，纯水溶解并定容至1.0 L。
2.2 色谱条件
色谱柱：SymmetryShildTM RP18(150 mm×3.9 mm，i.d.，5 μm，美国Waters公司)。流动相：0.1%甲酸水溶液(A)乙腈(B)。梯度洗脱条件： 94% A(0 min)，93% A(5 min)，93% A(15 min)，90% A(20 min)，85% A(25 min)，40% A(41 min)，30% A(42 min)，94% A(43 min)，94% A(55 min)。流速：0.7 mL/min;进样量：100 μL;柱温：30 ℃。紫外检测波长：280 nm。程序荧光检测波长： 0～11 min， λex=297 nm，λem=515 nm;11～25 min，λex =280 nm，λem =450 nm;25～55 min，λex =320 nm，λem =365 nm。
2.3 样品前处理
准确称取(2.00±0.02) g匀浆猪和鸡肌肉组织于50 mL聚丙烯离心管中，加入8 mL磷酸盐缓冲液，涡动1 min，以3800 r/min离心10 min，上清液倒入另一个50 mL聚丙烯离心管中;向组织凝块中加入8 mL磷酸盐缓冲液重复提取一次，合并上清液，向上清液中加14 mL水，涡动混匀，以3800 r/min离心10 min，取上清液，过HLB固相萃取柱(2 mL甲醇活化和2 mL水平衡)，5 mL甲醇水(1∶4，V/V)洗涤，2 mL 甲醇洗脱于刻度试管中，45 ℃水浴中氮气吹至近干。用磷酸盐缓冲液定容至1 mL，涡动30 s，以0.22 μm针孔式滤膜过滤，取100 μL进HPLC分析，QNs用FLU检测器检测，SAs和TMP用UV检测器检测。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件的选择
由于结构和化学性质的差异，同时检测和分离两类以上结构不同药物对色谱条件要求较高。本研究分别对多种型号和规格的色谱柱进行考察和比较，采用SymmetryShildTM RP18色谱柱可成功分离QNs、SAs和TMP。
QNs和SAs均为两性化合物，流动相酸度对其分离影响很大，而且QNs在酸性溶液中有较强荧光发射[18]。本实验采用甲酸水溶液乙腈体系为流动相，对不同浓度甲酸的分离效果进行了比较，降低甲酸的浓度会导致QNs的色谱峰拖尾，而且3类药物不能完全分离，最终选择0.1%甲酸乙腈体系作为流动相。
通常，SAs和TMP使用UV检测器，而QNs常使用FLU检测器，且不同的QNs的荧光光谱又相差较大。本实验采用常规的UV检测器串联程序波长FLU检测器测定样品，一次进样可以同时检测3类药物，而且都能获得较高的灵敏度。程序FLU检测波长见2.2项。FLU和UV检测器各药物的色谱峰尖锐、对称(见图1)。图1 标准品色谱图(a, d, g, j);猪肉添加色谱图(b, e);空白猪肉色谱图(c, f);鸡肉添加色谱图(h, k);空白鸡肉色谱图(i, m)
1. 甲氧苄啶(trimethoprim); 2. 麻保沙星(marbofloxacin); 3. 磺胺嘧啶(sulfadiazine); 4. 氧氟沙星(ofloxacin); 5. 磺胺吡啶(sulfapyridine); 6. 磺胺噻唑(sulfathiazole); 7. 环丙沙星(ciprofloxacin); 8. 洛美沙星(lomefloxacin); 9. 单诺沙星(danofloxacin); 10. 恩诺沙星(enrofloxacin); 11. 磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine); 12. 沙拉沙星(sarafloxacin); 13. 磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine); 14. 磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole); 15. 恶喹酸(oxolinic acid); 16. 磺胺苯酰(bensoylsulfanilamide); 17. 氟甲喹(flumequine)。3.2 样品前处理条件的优化
本研究试图减少毒性大的有机溶剂在提取和净化中的使用，磷酸盐缓冲液可以有效提取(氟)喹诺酮类药物[8,19]，但磷酸盐缓冲液提取组织样品中SAs的方法报道很少[15]。本研究考察了不同组成、不同浓度、不同pH值的多种磷酸盐缓冲液的提取效果，最后确定采用K2HPO4KH2PO4缓冲液(pH=6.0)同时提取猪和鸡肌肉中的QNs, SAs和TMP，并对提取条件进行了优化，取得了满意的回收率，结果见表1。
多类药物的残留分析方法常采用较复杂的前处理过程，本研究对多种固相萃取柱进行比较，最后采用单个HLB固相萃取柱同时净化QNs, SAs和TMP，获得较好的净化效果。组织提取液加水稀释后离心，可以减少共萃取杂质的干扰，加快提取液过柱的速度，防止固相萃取柱阻塞。在柱洗脱过程中，用1 mL甲醇洗脱，只有磺胺苯酰的回收率较低(<60%)， 增加1 mL甲醇，磺胺苯酰的回收率提高，且不增加共萃取杂质的干扰。整个提取和净化过程仅采用甲醇一种有机溶剂，体积仅8 mL，避免了大量使用有机溶剂对环境的污染。表1 猪、鸡肌肉组织中药物的添加回收率及精密度测定
3.3 检测方法的验证
所有药物在相应的浓度范围内，呈良好的线性关系，相关系数r>0.9987。低、中、高3个浓度的样品添加回收率为70.6%～103.4%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～11.4%; 可以满足残留分析的需要，结果见表1。典型的标准品、肌肉添加和空白肌肉色谱图见图1。
取空白的肌肉样品，平行10份，按2.3样品前处理的方法处理，QNs用FLU检测器检测，SAs和TMP用UV检测器检测，以信噪比S/N=3为检出限，S/N=10为定量限。SAs和TMP的检出限和定量限分别为3.5和12 μg/kg。QNs的检出限和定量限分别为0.2和1.0 μg/kg(其中，单诺沙星为0.04和0.2 μg/kg;麻保沙星为0.4和2.0 μg/kg; 沙拉沙星为0.4和2.0 μg/kg)。
【参考文献】
1 Shen JianZhong(沈建忠), Xie LianJin(谢联金).Veterinary Pharmacology(兽医药理学). Beijing(北京)：China Agricultural University Press(中国农业大学出版社), 2000： 162～167
2 Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China(农业部), 235th bulletin(235号公告), 2002
3 Council Regulation (EEC) no. 2377/90 of 26 June 1990, Off. J. Eur. Commun. L224 (1990) 1
4 Wu YinLiang(吴银良), Liu SuYing(刘素英), Shan JiHao(单吉浩), Wang Hai(王 海). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2005, 33(12)： 1713～1716
5 Fun M R S, Chu S T. Anal. Chim. Acta, 2003, 499: 215～221
6 Wang ManXia(王曼霞), Du LiMing(林黎明), Qiu Fang(邱 芳), Hu YongMing(胡永明). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2004, 32(11)： 1421～1425
7 Xiong Fang(熊 芳), Dai Hua(戴 华), Yuan ZhiNeng(袁智能). Journal of Analytical Science(分析科学学报), 2002, 18(5)： 415～417
8 Liu Yuan(刘 媛), Xie MengXia(谢孟峡), Ding Lan(丁 岚), Shan JiHao(单吉浩), Yang QingFeng(杨清峰), Liu SuYing(刘素英).Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2004, 32 (3)： 252～255
9 Bailac S, Ballesteros O, JiménezLozano E, Barrón D, SanzNebot V, Navalón A, Vílchez J L, Barbosa J. J. Chromatogr. A, 2004, 1029: 145～151
10 Zhang HaiQi(张海琪), Song LiLi(宋琍琍), Xu XiaoLin(徐晓林), He ZhongYang(何中央), Zhang ChenHui(张晨辉), Hou JingDe(侯镜德). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2007, 35(2): 268～272
11 Toussaint B, Chedin M, Vincent U, Bordin G, Rodriguez A R. J. Chromatogr. A, 2005, 1088: 40～48
12 Pang GuoFang(庞国芳), Cao YanZhong(曹彦忠), Zhang JinJie(张进杰), Jia GuangQun(贾光群), Fan ChunLin(范春林), Li XueMin(李学民), Liu YongMing(刘永明), Shi YuQiu(石玉秋). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2005, 33(9)： 1252～1256
13 Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China(农业部), 1025th bulletin (1025号公告), 2008
14 Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China(农业部), [2001]38th bulletin (农牧发[2001]38号文), 2001
15 Li C, Jiang H Y, Zhao S J, Zhang S X, Ding S Y, Li J C, Li X W, Shen J Z. Chromatographia. 2008, 68(12): 117～121
16 Granelli K, Branzell C. Anal. Chim. Acta, 2007, 586: 289～295
17 Liu PengYan(刘芃岩), Jiang Ning(姜 宁), Wang HongYu(王洪宇). Chemistry(化学通报), 2006, 69(8): 572～576
18 Li JianQing(李建晴), Feng XiaoHua(冯小花), Shuang ShaoMin(双少敏), Dong Chuan(董 川). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2003, 31(1): 19～23
19 Zhao SiJun(赵思俊), Li Cun(李 存), Jiang HaiYang(江海洋), Li BingYu(李炳玉), Shen JianZhong(沈建忠). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2007, 35(6): 786～790
|
|
|
广告服务