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高效液相色谱法测定家蝇细胞色素P450 O脱甲基活性
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【西医学科论文】作者：艾国民 王庆敏 邹东云 高希武 李富根【摘要】 建立了以乙酸乙酯/正己烷为终止剂(含1% H3PO4)和萃取剂，利用高效液相色谱，ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱，梯度洗脱，在316 nm检测，外标法分析对硝基苯酚的生成量，表征家蝇粗酶液中细胞色素P450催化的对硝基苯甲醚 O脱甲基活性的新方法。本方法的检出限为0.1 ng; 分析精密度的RSD为1.02%; 0.351, 1.755和8.755 μg对硝基苯酚3个添加水平的回收率为92.34%～87.60%; 回收率的RSD为2.64%～5.90%;对硝基苯酚在9.72～486 ng范围内，线性关系良好， r=0.9995。应用本方法比较了家蝇吡虫啉抗性品系与敏感品系细胞色素P450的活性差异。结果表明，家蝇抗性品系的P450 O脱甲基活性是敏感品系的3.34倍; 细胞色素P450活性的提高是家蝇对吡虫啉产生抗性的一个重要机制。
【关键词】 高效液相色谱，O脱甲基，细胞色素P450，家蝇，吡虫啉
1 引 言
细胞色素P450酶系，又称多功能氧化酶，存在于从细菌、真菌、植物到动物的全部生物体中[1]。细胞色素P450与内源物质甾类激素、脂类等的代谢有关。更多的P450是与外源物质(如天然产物、药物、农药等)的解毒代谢有关。昆虫P450对外源物质的代谢造成了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性[2]。不同的P450异构酶所催化底物具有相对特异性和重叠性，需要测定对不同底物的催化活性。对一种底物，其测得的P450催化活性也是多种异构酶的总活性[2]。在昆虫毒理学研究中，通常测定P450的O脱烷基酶、芳烷基羟基化酶以及艾氏剂环氧化酶的活性，来判断P450在杀虫剂抗性形成过程的作用[3]。P450 O脱烷基活性通常以O脱甲基和/或O脱乙基活性来表示。P450 O脱甲基活性是以对硝基苯甲醚(pNA)为底物，采用紫外可见比色法[4]或GCFID[5]来表征;或以甲氧试卤灵[6]、7甲氧基香豆素[7]为底物，采用荧光比色法来表征。P450 O脱乙基活性，是以7乙氧基香豆素为底物，采用荧光比色法[8]或HPLC荧光检测法[9]表征;或以7乙氧基试卤灵[10]、7乙氧基三氟甲基香豆素[11，12]为底物，采用荧光比色法表征。近年来，研究人员合成了一系列α腈基酯类化合物，其在P450的作用下发生O脱烷基反应，脱烷基产物发生重排而生成强荧光的6二甲基氨基2萘醛(6DMANA)，通过对重排产物的荧光测定来表征P450 O脱烷基活性[13]。基于色谱法的强分离特性和质谱的强定性能力，建立了相应的色谱或色谱质谱联用的分析方法[5，9，14]。
昆虫细胞色素P450的活性较低。本实验建立了准确测定家蝇粗酶液中细胞色素P450 O脱甲基酶活性的高效液相色谱分析方法，细胞色素P450介导的对硝基苯甲醚O脱甲基反应如下：
通过定量分析产物对硝基苯酚的生成量，来表征细胞色素P450的活性，用于分析细胞色素P450在家蝇对杀虫剂吡虫啉抗性形成中的作用。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
1100 Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配备DAD检测器和化学工作站;T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。苯甲基磺酰氟(PMSF，99.0%)、1苯基2硫脲(PTU，98.0%)、NADPHNa4 (98.0%)、对硝基苯酚(99.0%)均购自SigmaAldrich公司;色谱纯的乙腈和甲醇均购自美国Fisher公司;Tris 碱(分析纯)和二硫苏糖醇(DTT，99.0%)购自美国Promega 公司;EDTA和牛血清白蛋白(BSA)购自北京同正生物公司;分析纯的对硝基苯甲醚、乙酸乙酯及正己烷等试剂均购自北京化学试剂公司;水为MilliQ超纯水。
家蝇(Musca domestica L.)，2007年6月采自中国农大东区摔跤馆附近，在室内饲养12代后，于家蝇二龄末幼虫期，用100～1500 mg/L吡虫啉连续筛选11代，获得家蝇吡虫啉抗性品系CRS(抗性倍数85倍)。敏感品系CSS为实验室饲养多年未接触任何杀虫药剂的品系。养虫室的温度为(25±1)℃，湿度为60%～70%，光周期为14 L∶10 D。
2.2 酶液制备及蛋白质浓度测定
酶液制备参考文献[15]，并略作修改。挑取大小均一的羽化第4天雌性成蝇，取腹部，在冰浴的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5，含15%甘油, 1.0 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L DTT, 1.0 mmol/L PTU, 1.0 mmol/L PMSF)中匀浆后，然后在4 ℃，10000×g离心20 min，上清液经脱脂棉过滤后得粗酶液，作为酶源。酶液制备均独立进行3次。采用文献[16]的方法，以BSA为标准品，测定蛋白质浓度。
2.3 色谱条件
Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，带保护柱。流动相为乙腈/水(冰乙酸调pH=3.0)。梯度洗脱：0～10 min，22%～50%乙腈; 10～14 min，50%乙腈;14～17 min，50%～100%乙腈;17～20 min，100%乙腈;20～23 min，100%～22%乙腈;23～28 min，22%乙腈;流速1.0 mL/min。等梯度洗脱液：乙腈/水(33∶67, V/V,冰乙酸调pH=3.0);流速1.0 mL/min。DAD检测波长316 nm;柱温25 ℃;进样量20 μL。
2.4 对硝基苯甲醚的O脱甲基反应
参考文献[4，15]的方法并加以修改。反应体系缓冲液为0.1 mol/L TrisHCl 缓冲液(pH 8.2)，总体积为2 mL，含315 μmol/L 对硝基苯甲醚、7.5 mmol/L MgCl2, 0.75 g/L BSA, 1 mmol/L NADPH。反应体系中加入0.5 mL 酶液启动反应，在30 ℃振荡水浴中温孵1 h后，加入2 mL冰冷的乙酸乙酯正己烷(2∶1，V/V，含1%浓H3PO4)混合溶剂终止反应，稍作振荡以充分萃取反应产物对硝基苯酚，然后再用2 mL乙酸乙酯正己烷的混合溶剂分两次萃取反应产物，合并萃取液，经氮吹仪吹干，200 μL甲醇超声振荡(10 s)溶解，冰浴，待HPLC分析。实验设酶液对照(不加底物)和底物对照(不加酶液)，以确保检测的产物来自酶促反应，而不是来自酶或底物的分解产物。以不同浓度的pNP标准品得到的标准曲线来定量反应产物。用每分钟每毫克蛋白产生的pNP的皮摩尔数来表示酶的活性：pmol/(mg·min)。
3 结果与讨论
3.1 HPLC分析方法的建立
3.1.1 检测波长的确定 经DAD检测器在200～800 nm全波长扫描，产物对硝基苯酚及底物对硝基苯甲醚紫外光区的最大吸收波长分别为316和312 nm，故确定检测波长为316 nm。
3.1.2 流动相的选择 梯度洗脱比较适合分析周期较长及分析样品较多的需要，故本实验采用梯度洗脱进行分析。在梯度洗脱条件下(图1)，产物对硝基苯酚(7.26 min)与底物对硝基苯甲醚(11.74 min)，酶液基质能达到完全分离，可以作为酶促反应后产物的分析条件，整个分析过程28 min。通过与对硝基苯酚标准品的保留时间和紫外吸收光谱对照，确定保留时间7.26 min的产物峰为家蝇P450介导的对硝基苯甲醚O脱甲基反应的产物——对硝基苯酚。酶液对照(不加底物)和底物对照(不加酶液)均未出现产物峰。 图1 梯度洗脱条件下，酶液对照(1)，底物对照(2)以及酶促反应混合物(3)的HPLCDAD分离图进样量(injection): 20 μL.
在等梯度洗脱条件下，产物对硝基苯酚(5.42 min)与底物对硝基苯甲醚(15.29 min)及酶液基质能达到完全分离，可以作为酶促反应后产物的分析条件，整个分析过程约20 min。本实验采用如上梯度洗脱程序，以排除可能出现的副产物的干扰，但分析周期较长。本研究的产物种类简单，可在等度洗脱到6 min后加快洗脱速度，缩短分析周期。
3.1.3 检出限 在梯度洗脱条件下，对硝基苯酚的检出限为0.1 ng(S/N=3)。等梯度洗脱条件下的检出限为0.04 ng(S/N=3); 而一般在梯度洗脱条件下，组分的检测灵敏度能所提高，这可能是因为在等度洗脱条件下基线更平稳，且保留时间(5.42 min)比梯度洗脱条件下(7.26 min)短;产物对硝基苯酚的极性较大，其容量因子较小，故用梯度洗脱程序时，其灵敏度受流动相极性变化的影响较小。
3.1.4 标准曲线 准确称取0.0234 g对硝基苯酚于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，在梯度洗脱条件下，稀释不同倍率进样。以峰面积和进样量(ng)进行线性回归，绘制标准曲线。在梯度洗脱条件下，对硝基苯酚的最低定量限为0.486 ng。考虑到本实验中产物的含量及添加回收率实验的需要，选取进样量(纵坐标)9.72～486 ng与峰面积进行线性回归，回归方程为y=0.2640x-3.1391，r=0.9995。同一样品溶液在上述梯度洗脱色谱条件下重复测定6次，峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.02%。
3.1.5 添加回收率 分析方法的准确度通过向反应体系中加入3个不同浓度的对硝基苯酚(0.351, 1.755和8.755 μg)来评价。因为对硝基苯酚的极性较大，需要用极性溶剂如乙酸乙酯等溶剂来提取。表1 产物对硝基苯酚的添加回收率考虑到乙酸乙酯有一定的水溶性，采用乙酸乙酯/正己烷(2∶1，V/V)混合溶剂作为反应的终止剂和萃取剂，在混合溶剂中加入1% H3PO4，可抑制对硝基苯酚在水中的电离，从而获得较理想的添加回收率。3个添加水平的回收率为87.60%～92.34%; 回收率的相对标准偏差为2.64%～5.90%(表1)，测定结果的准确度较高。3.2 家蝇吡虫啉抗性品系与敏感品系的P450 O脱甲基活性比较
家蝇抗性与敏感品系中细胞色素P450催化对硝基苯甲醚的O脱甲基反应同时进行。结果表明，家蝇吡虫啉抗性品系的对硝基苯甲醚的O脱甲基酶活性与敏感品系相比显著增强，其活性是敏感品系的3.34倍(表2)，这可能是家蝇对吡虫啉产生抗性的重要原因。吡虫啉于2004年在美国登记用于防治家蝇[17]，其在家蝇中的代谢能被增效醚(PBO，一种细胞色素P450单加氧酶抑制剂)所抑制，表明细表2 家蝇吡虫啉抗性品系与敏感品系的P450 O脱甲基活性差异(R/S)抗性品系 CRS strain458.99±2.61敏感品系 CSS strain137.49±11.063.34胞色素P450介导了吡虫啉的代谢[18]。本实验结果表明，细胞色素P450酶系在家蝇对吡虫啉的抗性形成中起了重要作用，此结果可以通过家蝇抗性与敏感品系对吡虫啉的代谢差异来验证。
3.3 结论
随着现代分离分析技术在哺乳动物对杀虫剂及模式底物代谢研究中的广泛应用，将会有更多的色谱及色谱质谱等分析技术应用于昆虫毒理学研究中，用以表征昆虫代谢酶系对杀虫剂或模式底物的代谢，从而阐述昆虫对杀虫剂产生抗性的代谢机制。本实验建立的HPLC法表征P450的O脱甲基活性，本方法的灵敏度和准确度均优于常用的紫外可见分光光度法。本方法可以排除其它酶系导致的副产物的干扰;可直接应用粗酶液为酶源，省去了常用的微粒体制备的步骤。
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