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硒化壳聚糖通过促进PMLRARα融合蛋白与分子伴侣Hsp90解离下调融合蛋白水平

【制药毕业论文】作者:邓守恒,蔡晓军,李林均,俞远东,李芳,陈萍【摘要】 目的研究硒化壳聚糖(Sc)下调NB4细胞PMLRARα融合蛋白的作用与分子伴侣Hsp90的关系。方法流式细胞术和免疫印迹法检测Sc处理后NB4细胞内PMLRARα融合蛋白、Hsp90含量的变化; RTPCR法分析Sc处理后细胞内PMLRARα mRNA水平的改变。结果Sc可下调NB4细胞内PMLRARα融合蛋白含量,呈量效关系,50,100,200 mg/L Sc处理24 h后细胞内PMLRARα融合蛋白阳性率分别为62.8%, 33.14% , 17.07%, Sc对细胞内PMLRARα mRNA水平没有影响;50,100,200 mg/L Sc处理NB4细胞24 h可使细胞内Hsp90含量减少。结论Sc下调PMLRARα融合蛋白的含量,主要通过抑制Hsp90分子伴侣的功能,使PMLRARα融合蛋白与Hsp90蛋白解离,PMLRARα融合蛋白失去正常的稳定性,进而被降解。
【关键词】 硒化壳聚糖; PMLRARα融合蛋白 ; Hsp90
 壳聚糖是存在于自然界中的一种碱性生物多糖,由于其生物相容性良好,几乎无毒性,没有其它不良反应,在现代药物制备中经常作为良好的药物材料进行开发。硒化壳聚糖[1](Selenium chitosan, Sc)就是将低分子量壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下,以混合金属离子为催化剂,通过拼合原理制备而成的一种有机硒。本组前期研究结果显示Sc能通过抑制体外培养的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞内特有的PMLRARα融合蛋白及其介导的Ras信号等途径来抑制细胞增殖,诱导其凋亡[2]。
热休克蛋白(heat shock protein ,Hsp)是一个大的蛋白超家族,主要功能是作为分子伴侣, Hsp90是其中最活跃的分子伴侣蛋白之一,许多信号转导蛋白正常功能的发挥都依赖于Hsp90, PMLRARα融合蛋白是Hsp90的 “客户”蛋白之一,它需要与Hsp90/p23伴侣复合物结合,才能获得稳定性,进而发挥抗凋亡、诱导耐药等活性。Sc是否通过抑制Hsp90的分子伴侣功能进而下调NB4细胞PMLRARα融合蛋白含量,目前尚未见报道,值得深入研究。
  1 材料
1.1 药品与试剂硒化壳聚糖(批号:100601200518)由福建医科大学药化系合成,含硒量为0.4%;Westernblot试剂盒、Taq酶和逆转录酶为Promega产品;Trizol为上海Sangon产品;RARα单抗,Hsp90单抗为 Santa Cruz产品; 正钒酸钠,胰蛋白酶肽,亮抑制肽为Sigma产品;其它试剂均为进口分装分析纯。
1.2 细胞株NB4细胞引自福建省血液病研究所,培养于含10%新生牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素和2 U/ml谷氨酰胺的PRMI1640培养液中,在37℃,5%CO2条件下培养,细胞接种24 h后进入指数生长期。
2 方法
2.1 流式细胞仪检测细胞PMLRARα融合蛋白各取处于指数生长期NB4细胞5×108/L,分别加入不同浓度Sc至50,100,200 mg/L,对照组加等量培养液后继续培养24 h,收集各组细胞各2×106个, 0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗两遍,调整细胞浓度为1×109/L,加入鼠抗人RARα单抗(1∶400稀释),混匀后4℃放置30 min,加入等量FITC标记的二抗,4℃继续孵育30 min,以FACScan 型流式细胞仪(BECTON DICKINSON)进行检测,实验设不加一抗的FITC标记二抗为对照以扣除非特异荧光背景,以CELL QuestTM 软件分析PMLRARα融合蛋白阳性表达细胞率。
2.2 RTPCR半定量检测细胞PMLRARα mRNA的水平[3]参照文献[3]方法进行半定量检测分析。
2.3 免疫印迹法检测HSP90含量收集各组经不同浓度Sc作用24 h后的NB4细胞各3×105个,PBS洗2次,裂解,离心,收集上清,即为细胞总蛋白,Lowry法蛋白定量,调节每份样品蛋白浓度,加等量蛋白于上样缓冲液,煮沸, SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后转膜,依次加入Hsp90单抗和二抗,显色,拍照,用灰度扫描仪(GelDoc1 000 model,BIORAD)进行半定量检测,重复3次。
2.4 统计学处理实验结果数据用±s表示,采用SPSS13.0软件进行t检验。
  3 结果
3.1 Sc对NB4细胞PMLRARα融合蛋白含量的影响NB4细胞经不同浓度Sc处理24 h后,流式细胞仪检测结果显示Sc可明显减少细胞内PMLRARα融合蛋白含量,药物剂量越高,作用效果越明显,空白对照组融合蛋白阳性率为91.3%,50 mg/L 组阳性率则降为 62.8%(P<0.05),100 mg/L 组为33.14%(P<0.01),200 mg/L 组为17.07%(P<0.01)。见图1。
3.2 Sc对NB4细胞PMLRARα mRNA水平的影响RTPCR结果显示,不同浓度 Sc作用NB4细胞24 h,对NB4细胞PMLRARα mRNA的水平未产生明显影响(见图 2)。半定量分析结果显示,50,100,200 mg/L与对照组之间条带的密度值亦无显著性差异(P>0.05)。
3.3 免疫印迹法检测Sc对NB4细胞Hsp90含量的影响从图3中可见,随着Sc浓度的提高,NB4细胞总蛋白的中Hsp90条带逐渐变浅,密度逐渐变小。灰度扫描结果显示,对照组蛋白条带灰度值为247±12, 50 mg/L组灰度值为234±17,两者比较无明显差异(P>0.05);而100 mg/L组和200 mg/L组灰度值分别为152±11和133±16,与对照相比则有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。 A-空白对照组 B-50 mg/L组C-100 mg/L组 D-200 mg/L 组图1 流式细胞仪检测NB4细胞内PMLRARα融合蛋白阳性率A对照组,0.89±0.014 B50mg/L,0.958±0.021C100mg/L,0.949±0.033 D200mg/L,0.969±0.029 F-Marker图2 RTPCR法检测NB4细胞内PMLRARα mRNA水平 (各条带密度值,±s,n=3)图3 免疫印迹法检测NB4细胞内Hsp90含量(±s,n=3)
4 讨论
肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程,其中癌基因和抑癌基因之间的协同或拮抗作用在肿瘤细胞增殖及转化中发挥着重要的作用,Hsp90作为分子伴侣,能与多种癌基因和抑癌基因产物结合形成异源蛋白复合体,介导基因产物构象成熟及转运,进而参与到细胞增殖和转化过程中去,研究表明Hsp90 在肿瘤细胞中的表达量比在正常细胞中的表达量高出2~10 倍[4], Hsp90在肿瘤细胞中主要处于活化态,在正常细胞中则主要处于静默态,处于活化态时,Hsp90与50多种客户蛋白如P210bcr/abl、cRaf、Mek、PMLRARα融合蛋白等及辅分子伴侣Hsp70、Hsp40、Hop、p23、cdc37等形成复合物,保护这些客户蛋白不被蛋白酶体所降解[5],由于Hsp90的客户蛋白中有许多是肿瘤细胞增殖信号传导通路上的重要分子,因此,抑制Hsp90的分子伴侣功能则意味着能同时阻断多条肿瘤细胞增殖信号传导通路。
本实验研究结果表明,Sc可剂量依赖性地减少NB4细胞内特有的PMLRARα融合蛋白含量,RTPCR的结果表明Sc对NB4细胞PMLRARα mRNA的水平未见明显影响,说明Sc是在翻译水平上抑制了融合蛋白的合成或促进了融合蛋白的降解,使其含量大幅度下降。 已知真核细胞内合成成熟有活性的蛋白质是一个非常复杂的过程,需要有大量的酶和蛋白因子参与,并在不同的细胞器中经过复杂加工修饰后,才能将经编码基因转录翻译后生成的没有活性的初级蛋白质转变成具有一定空间构象的有活性的蛋白质,热休克蛋白家族做为参与蛋白质翻译后加工修饰所需的蛋白因子中的一部分,能以ATP依赖的形式与许多蛋白相互作用,并通过其结合和解离参与靶蛋白的折叠、亚基间装配、细胞内运输及降解,以调节靶蛋白的活性和功能[6,7]。本研究免疫印迹结果表明Sc具有下调Hsp90分子伴侣的功能,其结果一方面可使未成熟的PMLRARα融合蛋白前身物质成熟受阻,另一方面可促使已成熟的PMLRARα融合蛋白与Hsp90解离,导致PMLRARα融合蛋白失去稳定性,进而被蛋白酶体降解,从而快速下调PMLRARα融合蛋白的含量,而Sc对其它客户蛋白及辅伴侣蛋白如P23、P60,Hop等的影响及蛋白酶体抑制剂可否逆转Sc对PMLRARα融合蛋白的下调作用还有待进一步研究。
【参考文献】
 [1] 孙兰萍,张胜义,许 晖. 硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究[J].食品工业科技 , 2006,27(2):145.
[2] 邓守恒.硒化壳聚糖对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞的作用及其机制探讨[OB/OL]。http://epub.cnki.net/grid 2008/detail.aspx?tilename=2007212276..
[3] 赫红英,滕智平,陆道培. 四氧化四砷对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的凋亡作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2002,16(1):37.
[4] Ferrarini M, Heltai S, Zocchi MR, et al. Unusual expression and localization of heatshock proteins in human tumor cells[J].Int J Cancer, 1992, 51(4):613.
[5] Chiosis G, Vilenchik M, Kim J, et al. Hsp90: the vulnerable chaperone[J].Drug Discovery Today, 2004, 9(20): 881.
[6] Lee GJ, Vierling E. A small heat shock protein cooperates with heat shock protein 70 systems to reactivate a heatdenatured protein[J]. Plant Physiol, 2000 ,122 (1):189.
[7] Park HS, Lee JS, Huh SH, et al.Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of cjun Nterminal kinase [J].EMBO J,2001,20(3):446.

 
 
 
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