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细胞融合构建红景天苷高转化菌株及固态发酵工艺优化
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【药学大专毕业论文】作者：冯敏，蒋春，高雪华，雷蕾，邓小晨【摘要】 目的构建红景天苷高转化菌株，并对红景天的固态发酵工艺进行优化。方法以黑曲霉菌株H35和H42为出发菌株，将双亲株的原生质体分别进行紫外和热灭活后进行原生质体融合，通过重氮盐比色法初筛和HPLC复筛得到一融合菌株(Rc14);并运用“复杂定向调控技术”对红景天固态发酵工艺进行优化。结果在最佳固态发酵工艺条件下，Rc14发酵后红景天苷含量比发酵前提高140%，酪醇含量提高277%，总有效成分含量增加了176%。结论利用融合菌株Rc14固态发酵红景天的工艺在红景天的工业生产中具有很高的应用价值。
【关键词】 原生质体融合; 红景天苷; 酪醇; 固态发酵
红景天是景天科(Crassulaceae)红景天属Rhodiola crenulata Hook.f.et Thoms植物，被誉为“高原人参”，主要有效成分是红景天苷(salidroside)和苷元酪醇(tyrosol) [1]，具有抗缺氧、抗衰老、抗病毒、抗疲劳、抗肿瘤、增强免疫力等作用。由于过度采挖，野生红景天资源日益枯竭。提高红景天苷含量或另辟它径的方法目前主要有：愈伤组织悬浮培养法、化学合成法和微生物转化法等方法，其中微生物转化法发酵条件温和，周期短，最有应用前景。在本文的前期研究中，已筛选到具有红景天苷转化能力的菌株，发酵后可将原药材中红景天苷含量提高52.83%[2]。由于红景天苷的合成需要两种以上的酶，通过双菌株混合液态发酵，酶作用的互补协同，红景天苷含量进一步提高到86.29%(文章另发)。但混合菌株发酵过程较难控制，并且液态发酵对设备和操作要求较高，成本高于固态发酵。
本文分别将具有较高酪醇合成能力及较高苷合成能力的两株转化菌作为亲本，通过原生质体融合达到相关基因重组，旨在筛选出红景天有效成分转化率更高的菌株;此外，对固态发酵工艺进行优化，为制取红景天苷产物的工业化生产提供一条新工艺路线，并为野生药用资源的保护性开发提供新思路。
1 材料与仪器
1.1 菌种黑曲霉(Aspergillus niger)H35和H42，均由本实验室提供。
1.2 药材大花红景天Rhodiola crenulata H.Ohba，产自四川省阿坝州，粉碎至80目。
1.3 培养基菌丝生长培养基、完全培养基(CM)、高渗CM固体培养基[3]。液体发酵培养基，红景天粉末与水以1∶20比例混合。固态发酵培养基：红景天粉末与水的比例为1∶1.2，添加(NH4)2SO40.1%和KH2PO40.1%。
1.4 试剂纤维素酶(Cellulase)、溶菌酶(Lysozyme)、蜗牛酶(Snailase)，用PBA溶解。酪醇标准品、红景天苷标准品购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。
1.5 仪器岛津LC-6A 高效液相色谱仪。
2 方法
2.1 原生质体制备及再生参照文献[3]的方法。
2.2 双亲灭活及原生质体融合 分别将H35和H42菌株的原生质体悬液(×106 /ml)进行紫外灭活8 min和热灭活(60℃)14 min。等量混合灭活后的两亲本原生质体悬液，在32℃下，加入35%PEG融合7 min，稀释后涂布于高渗CM平板上，于30℃培养48 h。计算融合率。融合率(%)=(A/B)×100%(A为双亲本融合后再生的菌落数 ;B为灭活前双亲本原生质体再生的菌落数)。
2.3 融合子的筛选
2.3.1 初筛从再生平板挑出融合菌株，接到红景天液体发酵培养基中，30℃摇瓶培养60h，发酵液用75%的乙醇以1∶8的比例提取，得到粗提液。用重氮盐比色法[4]检测红景天总有效成分。
2.3.2 复筛经液态培养后，用HPLC检测发酵粗提液中红景天苷和酪醇的含量[5]。
2.3.3 色谱条件高效液相色谱仪色谱柱YWM-C18(10u) 4.6 mm×200 mm;流动相为甲醇∶水=25∶75 ;波长275 nm;柱温25℃;进样量10 μl;流速1.0 ml/min.。制作红景天苷和酪醇的标准曲线。根据峰面积计算出红景天苷和酪醇的含量。
2.4 红景天固态发酵将融合菌株接入红景天固态发酵培养基中，30℃下培养3～4 d，用75%的乙醇提取得到发酵粗提液，用于HPLC检测。
3 结果
3.1 双亲灭活及原生质体融合H35紫外照射8 min时，H42在60℃热灭活至14 min时，原生质体完全灭活。双亲株原生质体分别采用紫外线和热灭活，损伤部位不同，融合后可以互补。此方法省去对双亲株做遗传标记的过程，简化操作，更易于筛选。 灭活后的双亲株在35%PEG-6000，0.01 mol/L CaCl2, pH7.5条件下融合，融合子检出率为4.05%。
3.2 重氮盐比色法初筛融合菌株从融合平板上挑取菌株48株，重氮盐比色法测定OD486的值，有27株菌能发酵提高红景天有效成分的含量(见表1)。其中有13株菌发酵红景天后，有效成分的含量高于双亲本H35和H42，其中，Rc14和Rc27提高明显。
3.3 HPLC复筛以峰面积(Y)与原药材液中红景天苷的量(X)作回归计算，结果显示，红景天苷含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系好，回归方程为Y=7 298 287.739 4x+7 971.750 6 ，r=0.999 7(n=6)。表1 融合菌株发酵红景天总有效成分的含量 将初筛有效成分较高的两菌株Rc14、Rc27进行液态发酵和HPLC复测，Rc14转化能力高于Rc27，最终选定的融合子Rc14。Rc14与两亲本H35、H42的HPLC对比测定结果见图1，含量分析见表2。a酪醇标品 b红景天苷标品 c红景天原药材提取液的HPLC图d融合子Rc14发酵后提取液的HPLC图e亲株H35发酵后提取液的HPLC图f亲株H42号发酵后提取液的HPLC图图1 融合菌株 Rc14与双亲本菌株发酵红景天液体的 HPLC图图1显示，酪醇标准品的保留时间约在9.6 min，红景天苷标品的保留时间约在3.7 min。红景天经Rc14发酵后的提取液中，红景天苷的峰值比原药材显著增大，并高于两亲株H35和H42。表2 融合子Rc14红景天发酵产物的HPLC分析由表2看出，与红景天原药材比，红景天苷含量提高83.2%，酪醇含量提高187%，总有效成分含量提高110.6%。融合子Rc14对红景天苷的转化能力比亲株H35提高42%，比亲株H42提高57%。说明经过原生质体融合，苷和苷元合成酶互补增强，转化红景天苷的能力大大提高。
红景天苷的生物合成分为两个阶段：一是苷元的合成;二是苷元和葡萄糖结合形成红景天苷。酪醇的合成途径可能有两条：莽草酸途径和丙二酸途径;红景天苷代谢的两个关键酶：UD葡萄糖基转移酶和B-D-葡萄糖苷酶[6]。菌株H35产合成红景天苷的酶能力较高，H42产合成酪醇的酶的能力相对较强，这两株菌通过融合，合成苷元的酶和合成红景天苷的酶协同互补，合成代谢流显著增强。同时可看出，苷元合成酶的酶活性高于苷合成酶活性，使得苷元的合成量明显高于红景天苷的合成量。融合菌株Rc14传代10次，转化合成红景天苷和苷元的能力未降低，遗传性稳定。
3.4 红景天固态发酵工艺条件优化发酵工艺优化试验采用“复杂系统定向调控技术”进行调控[7]。发酵系统的关键构件有8个因素，X1为料水比，X2为接种量(%)，X3为发酵时间(h)，X4为MgSO4(%)，X5为(NH4)2SO4(%)，X6为KH2PO4(%)，X7为发酵温度(℃)，X8为初始pH，采用Y1为红景天苷的含量(%)，Y2为酪醇的含量(%)作为评价系统的标准。设计了3项抽样实验，实验设计及结果见表3。通过对以上8因素组成系统考察后，应用 “复杂系统定向调控技术”，计算分析后，去除X4对结果无明显影响的因素，对于新的7因素系统继续诊断调控，实验设计及结果见表4。考察系统行为，为了达到系统因素的最优化配置，进一步实施调控，优化实验设计如表5所示，使系统目标产量达到最大值。表3 8因素系统行为诊断实验设计及结果表4 系统行为进一步诊断实验设计及结果表5 系统优化实验设计及结果由表5知，红景天最优的固态发酵工艺条件：料水比为1∶1.2，接种量为10%，发酵时间为84 h，添加(NH4)2SO4的量为0.1%，KH2PO4为0.1%，发酵温度为30℃，初始pH为5.0。按此优化的工艺条件，用Rc14菌株进行红景天固态发酵。HPLC分析结果见图2和表6。a红景天原药材 bRc14固态发酵后提取液的HPLC图 提取液的HPLC图图2 红景天固态发酵前后的HPLC分析表6 系统优化实验设计及结果
4 讨论
在国内外有关提高红景天苷产量的研究中，用愈伤组织培养法合成红景天苷，产量低，为555.13mg/L，且需培养35 d[8];以对羟基苯乙酸为原料的化学合成法，操作复杂，产率为63%[9]。利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶，以酪醇和葡萄糖为底物，催化合成红景天苷，成本高，产率为71.9%[10]。而本研究通过微生物转化菌株间原生质体融合构建了红景天苷高产菌株Rc14，红景天苷和总有效成分转化率较前文报道有大幅度的提高，并为需要多步骤合成次级代谢产物途经的微生物转化提供了实例。据本文酪醇含量较高的发酵结果，还有较大的进一步提高空间。本文采用的微生物固态发酵方式设备简单、操作简便、成本低、产量高。经初步测算，扣除发酵生产成本，微生物转化法盈亏平衡点在红景天苷提高15%左右。本研究结果，红景天苷提高140%，已远远超过盈亏平衡点，具备很高的应用价值和经济效益。按红景天苷同等含量计算，原直接醇提法生产工艺的消耗原药材1吨，用融合子Rc14优化后的固态转化工艺，仅用原药材约0.42吨，利润率提高约5倍，野生资源的利用率提高140%，从而实现野生藏中药材的保护性开发。
【参考文献】
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[10] 王梦亮，李万丽.固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究[J].生物技术，2009，19(1)：68.
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